欧美阿v,亚洲精品乱码在线观看,亚洲男人天堂网,99久久人妻无码精品系列

技術(shù)文章

Technical articles

當(dāng)前位置:首頁(yè)技術(shù)文章組織培養(yǎng)細(xì)胞的裂解

組織培養(yǎng)細(xì)胞的裂解

更新時(shí)間:2012-10-08點(diǎn)擊次數(shù):1456

對(duì)于組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)的細(xì)胞,zui有效的裂解方法是用去污劑進(jìn)行處理。雖然有多種去污劑可用于裂解細(xì)胞,但zui常用的是TritonX—100或NP—40等非離子型去污劑。非離子型去污劑能溶解胞質(zhì)和細(xì)胞膜,破壞分子間許多微弱的結(jié)合鍵,并能溶解大部分經(jīng)常研究的蛋白質(zhì)抗原,但對(duì)于大分子多聚抗原則無(wú)效,在大多數(shù)情況下該抗原也是難以研究的。濃度介于0.1%~1%的去污劑即可滿(mǎn)足幾乎所有溶解需求。非離子型去污劑裂解液一般補(bǔ)充等離子濃度的鹽和接近中性的pH。

 
    在某些情況下,需要較劇烈的抽提條件以釋出所研究的抗原或除去微弱的相關(guān)蛋白。此時(shí),推薦使用RIPA裂解緩沖液,該體系含離子型和非離子型去污劑,具有相當(dāng)大的變性能力。除細(xì)胞內(nèi)不溶性蛋白外所有可溶性蛋白分子均可釋出,并能破壞大部分非共價(jià)的相互作用。
 
    除非有特殊原因,推薦在裂解緩沖體系中加入蛋白酶抑制劑混合液。在新抗原研究的早期使用蛋白酶抑制劑總是有利的。在該蛋白已被定性后,可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以了解這些抑制劑是否在所有情況下都必需。如前所述,終止蛋白酶作用的方法是在免疫沉淀的全部過(guò)程中溶液保持低溫。
 
    如果研究經(jīng)磷酸化修飾的蛋白質(zhì)時(shí),應(yīng)考慮加入磷酸酶抑制劑。
    1.準(zhǔn)備工作
    由于免疫沉淀有多個(gè)步驟,且包括數(shù)小時(shí)孵育,因此在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前必須安排好時(shí)間,注意適當(dāng)利用過(guò)夜孵育的時(shí)間間隔。這將有助于決定何時(shí)開(kāi)始裂解細(xì)胞。
    2.所需溶液
    PBS,裂解緩沖液(4℃預(yù)冷)。
    3.操作步驟
    (1)單層細(xì)胞的培養(yǎng),用室溫PBS洗細(xì)胞一次,然后甩干;懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞,400g離心10min,收集細(xì)胞棄上清液。
   (2)對(duì)于單層細(xì)胞培養(yǎng),將培養(yǎng)瓶置于冰上,每lOOmm培養(yǎng)瓶加入1 mL溶解緩沖液(4℃預(yù)冷);對(duì)于懸浮培養(yǎng),將盛細(xì)胞團(tuán)的試管置于冰上。按107個(gè)細(xì)胞加入1.0ml裂解液(4℃預(yù)冷)。
    保存在冰箱的裂解液可隨時(shí)使用。
    (3)冰上放置3min,不時(shí)敲擊貼壁細(xì)胞培養(yǎng)瓶,或輕搖懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。
    (4)對(duì)于單層細(xì)胞培養(yǎng),敲擊培養(yǎng)瓶數(shù)次,混合均勻,在冰床上傾斜培養(yǎng)瓶使溶液集中于一側(cè),然后將裂解物移置另一支1.5mL圓錐形試管。有些研究者喜歡從瓶壁刮取細(xì)胞,但除特殊要求外此舉并非必須。
    (5)單層培養(yǎng)的細(xì)胞或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞均以10 000g,413離心10min,仔細(xì)吸取上清液盛于另一試管,不可攪動(dòng)細(xì)胞團(tuán)。置冰上。
此時(shí),上清液可用于下一步的預(yù)處理。
 
    4.常見(jiàn)問(wèn)題   
    上述程序zui普遍的問(wèn)題是抗原不*從細(xì)胞內(nèi)釋放??梢酝ㄟ^(guò)對(duì)裂解液和細(xì)胞殘?jiān)M(jìn)行免疫印跡來(lái)檢查抗原是否*釋放。改變裂解液所用的去污劑是增加抗原釋放的zui有效方法。
    機(jī)械性剪切也可破壞細(xì)胞膜,常見(jiàn)的方法包括使用超聲波發(fā)生器、Dounce勻漿器、波特器和攪拌器等。這些方法特別適用于大體積制備或需避免使用去污劑時(shí)。在這些方法中,zui溫和的方法是使用Dounce勻漿器,但僅適合于較大體積的標(biāo)本(數(shù)毫升或更多)。
    一般不推薦凍融法,因反復(fù)凍融會(huì)使蛋白質(zhì)過(guò)量降解,其原因不明。除非所研究的抗原特別能耐受蛋白水解作用或者事先已測(cè)試過(guò)該方法,一般不作為。通常,用去污劑裂解是免疫沉淀的方法。

 

亚洲欧美日韩中文字墓| 精品日韩一区| 先锋av激情网| 国产日本亚洲精品| 国产精品免费观看调教网| 日本人妻夜夜操天天插| 色播三级级在线| 亚洲中文字幕无码久久2017| 日韩中文字幕在线爽死| 国产一区二区免费| 超碰97人妻免费| 午夜免费视频啪啪啪| 国产真人一级a爱做片| 国产日产欧美一区二区三区| www亚洲天堂| 欧美色图网站视频在线| 景谷| 天堂久久最新版| 日韩电影中文字幕不卡| 色噜噜人妻丝袜av先锋影音先| 你懂的网址在线| 欧美亚洲激情小说网止| 无码乱伦三区| 欧美一级一级| 91爆炒美女| 玛曲县| 色综合久久中文字幕| 亚洲一级色图| 603613| 日本乱人伦在线观看| 九九九综合色| 一个a色视频| 国产高清在线精品一区| 欧美精品xxxⅹ| 亚洲成人激情影视| 九九热精品在线| 四虎国产视频| 狠狠 中文字幕| 激情图区中文字幕| 久久亚洲精品人成综合网| 深夜久久久老司机视频|