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瓊脂糖膠體電泳 (agarose gel electrophoresis)

更新時(shí)間:2013-02-21點(diǎn)擊次數(shù):1206

儀器用具:
迷你電泳槽及鑄膠器 (Mupid II);UV transilluminator 及影像分析系統(tǒng);防護(hù)面罩

藥品試劑:
瓊脂糖粉末 (agarose, low EEO)
1×TAE電泳緩沖液 (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0):
由50×TAE (每1 L含242 g Tris base, 57.1 mL glacial acetic acid, 100 mL的0.5M EDTA-8.0) 稀釋使用。
10×追蹤染劑 (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 0.1 M EDTA, 50%glycerol)
Ethidium bromide (EtBr) stock solution:500 μg/mL,裝于滴瓶中,每50 mL膠體溶液加一滴 (zui終濃度為0.5 μg /mL)
DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量:
DNA/HindIII fragments:包含8 個(gè)片段23.1, 9.4, 6.5, 4.3, 2.3, 2.0, 0.56, 0.125kb ,濃度為0.5 μg/μL,以下簡(jiǎn)稱 λMr。
1 Kb DNA Ladder Fragments: 250 bp~10 kb共14 個(gè)DNA片段,濃度為0.5 μg/μL,以下簡(jiǎn)稱LadMr。

方法步驟:
1) 每組制備一片12-well 1.2% agarose gel: 秤取適量agarose 粉末,加入1×TAE(大片Mupid II 膠片約需40 mL),以微波爐加熱溶解后,置55℃水浴降溫。
◆ Ethidium bromide 為突變劑,以下操作請(qǐng)務(wù)必戴手套,并禁止戴著手套的手到處亂摸!
2) 加入EtBr (每50 mL 膠體溶液加一滴stock solution),混合均勻,將膠體溶液倒入鑄膠模,插上樣本梳。置室溫凝結(jié)后,小心拔開(kāi)樣本梳,將膠片置于電泳槽中,倒入1×TAE,直至溶液蓋過(guò)膠片。
3) 樣品DNA 及DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量各加入1/10 體積的10×追蹤染劑。將樣品及λMr 置65℃水浴5~10 min,移至冰浴降溫后,即可加入膠片的樣品槽。
◆ LadMr 請(qǐng)勿加熱!
4) 以50V 或100V 進(jìn)行電泳,待追蹤染劑bromophenol blue 行進(jìn)至膠體三分的二處時(shí),關(guān)閉電源,取出膠片,以UV transilluminator box 觀察色帶位置,并照相記錄結(jié)果。
◆ 請(qǐng)務(wù)必戴防護(hù)面罩,以免受到UV 傷害。
5) 與標(biāo)準(zhǔn)分子量比較,估計(jì)各DNA 片段的分子量并建立質(zhì)體pBluescript 的限制圖譜。
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