A.噬菌體的制備
1．挑取含有源自文庫(kù)篩選的噬菌體克隆的單菌落。用滅菌牙簽挑取單菌落接種于滅菌圓底培養(yǎng)板的微孔內(nèi)，其中加有150ul含15ug/ml的四環(huán)素的2×TY培養(yǎng)基。用一個(gè)微孔培養(yǎng)展示野生型DNA/RNA結(jié)合區(qū)域的噬菌體，作為陽(yáng)性對(duì)照。以250r/min的速度小心振蕩微孔板，30℃培養(yǎng)16小時(shí)。
2．在合適的吊斗式離心機(jī)中3700g離心96孔培養(yǎng)板15分鐘，以制備噬菌體上清液。將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的微孔板內(nèi)，4℃保存。

B.噬菌體ELISA
1，將生物素聯(lián)結(jié)的核酸靶標(biāo)位點(diǎn)（通常是0～5pmol之間，稀釋于50ul PBS緩沖液中）加入鏈親和素包被的微孔板內(nèi)。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照，將適量的野生型結(jié)合位點(diǎn)加入一個(gè)微孔內(nèi)。用一個(gè)只含PBS緩沖液的微孔作為陰性對(duì)照，以測(cè)定ELISA的本底。將微孔板于20℃放置15分鐘。
2．每孔加入150gl含有4％（w/v）脫脂牛奶的PBS緩沖液作為封閉劑。將微孔板于20℃放置1小時(shí)。
3，將噬菌體上清液（得自步驟A2）1；10稀釋于lml含有2％（w/v）脫脂牛奶、1％（體積分?jǐn)?shù)）Tween-20及20ug/ml的超聲破碎的鮭魚(yú)精DNA的PBS緩沖液中。
4．將核酸包被的微孔中的封閉液棄去，加入50ul稀釋過(guò)的噬茵體上清液。將微孔板于20℃放置l小時(shí)。
5．將結(jié)合液棄去，用200ul含1％（體積分?jǐn)?shù)）Tween—20的PBS緩沖液洗滌7次，再用PBS緩沖液?jiǎn)为?dú)洗滌3次。
6．將HRP聯(lián)結(jié)的抗M131gG抗體用含有2％（w/v）脫脂牛奶的PBS緩沖液作l：5000稀釋?zhuān)缓竺靠准尤?0g1。20℃放置l小時(shí)。
7．將抗體結(jié)合液棄去，用200ul含0．05％（體積分?jǐn)?shù)）Tween—20的PBS緩沖液洗滌3次，再用PBS緩沖液?jiǎn)为?dú)洗滌3次。
8．加入100ul HRP底物液，如上文所述的基于TMB的顯色液，使ELISA顯色。約5分鐘后終止顯色反應(yīng)，如使用TMB，則加入100ul 1 mol/L的硫酸。立即用酶標(biāo)儀測(cè)定ELISA數(shù)值。
9．要評(píng)估篩選出的結(jié)合區(qū)域的特異性序列的結(jié)合性，將它們的ELISA數(shù)值與陽(yáng)性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的數(shù)值進(jìn)行比較。

http://r9600.cn/