PCR是極為重要的DNA增殖技術(shù),應(yīng)用層面非常廣,其中包括了
核酸探針的制備。如果一段DNA已經(jīng)被次選殖至載體上,要以PCR擴(kuò)增這段DNA時(shí),可根據(jù)質(zhì)體multiple cloning sites兩邊的序列,選用適當(dāng)?shù)暮怂嵋?(universal primers) 進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng);比較常用的引子包括SP6, T3 與T7 promoter primer, M13/pUCforward與reverse primers等;若有特殊考量,也可以使用序列專(zhuān)一性核酸引子對(duì)。進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)若同時(shí)添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP,所增殖的DNA即被32P或DIG所標(biāo)定,所以PCR是制備核酸探針?lè)浅1憬莺糜玫姆椒ā?/div>
儀器用具:微量離心機(jī);PCR 反應(yīng)器
藥品試劑:
模版DNA: pBlueGus 質(zhì)體DNA (~50 pg)
核酸引子對(duì): T3 promoter primer 與T7 promoter primer (各2 μM)
礦物油 (是否需要視PCR反應(yīng)器機(jī)型而定)
PCR DIG probe synthesis kit (Roche), 內(nèi)含:
Taq DNA polymerase (Expand High Fidelity, 3.5 U/μL)
10×PCR DIG probe synthesis mix (2 mM dATP, dCTP, dGTP, 1.9 mM dTTP,及0.1 mM DIG-11-dUTP, pH 7.0)
Expand high fidelity buffer with MgCl2 (10×)
方法步驟:
以下反應(yīng)條件主要參照PCR DIG probe synthesis kit 制造廠(chǎng)商所提供的產(chǎn)品說(shuō)明。
1) 取一支0.5 mL微量離心管,依下表逐一加入各項(xiàng)試劑 (單位 μL):
2) 以手指頭輕彈管壁使各項(xiàng)試劑混合均勻。
3) 短暫離心后,徐徐加入100 μL 礦物油。
◆ 有些PCR 反應(yīng)器不需使用礦物油。
4) 在PCR 反應(yīng)器上設(shè)定PCR 反應(yīng)條件:Denaturation: 94℃/10 min
擴(kuò)增反應(yīng):
30 循環(huán)的 [94℃/45 s → 55℃/1 min → 72℃/2 min]
zui后的elongation step:72℃/10 min
5) 將微量離心管移至反應(yīng)器上,并開(kāi)始進(jìn)行PCR 反應(yīng)。
6) 反應(yīng)完成后,以微量移液器吸出礦物油,并取出5 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物,進(jìn)行洋菜膠體電泳分析。